试剂盒清单:
活化磁珠:保存于DMSO中,室温保存。
缓冲液A:偶联反应液,4度保存。
缓冲液B:封闭液, 用缓冲液A溶解的氨基配体(比如BSA、甘氨酸),浓度为20mg/ml,现配先用,自行配制。
缓冲液C:淋洗液,含有千分之一吐温20的PBS溶液,现配先用,自行配制。
缓冲液D:保存液,含有万分之五叠氮钠的PBS溶液,现配先用,自行配制。
试剂S:偶联促进剂。
磁珠的预处理
磁珠已活化,保存在DMSO溶液里,请在偶联配体前,取出所需量的磁珠,用0.5ml缓冲液A淋洗磁珠,磁液分离去除上清,重复淋洗两次。
偶联配体(以抗体为例)
1.抗体的预处理: 如果抗体里含有其他氨基、巯基的杂质分子,需通过透析、G-25等手段将杂质分子去除,以免对抗体造成竞争性反应,(比如Tris,甘氨酸,BSA等);
2.将预处理好的磁珠10mg放入偶联反应瓶中,加入200ul缓冲液A,然后加入250ug-500ug的抗体(我们**磁珠量mg:抗体量mg=20:1,也可减少抗体用量)
注:为缩短偶联反应时间,可以加入试剂S,W(试剂S加入量)=0.185*V(步骤2的总体积ml)g
3.偶联反应:将偶联反应瓶拧紧放入恒温摇床中,恒温25度震荡6小时,保证震荡混匀,
防止磁珠震荡过程中出现沉淀或者挂壁现象。.(可以将偶联反应时间延长到12小时达到更好的偶联效果);
4.封闭:向偶联反应瓶中加入400ul缓冲液B ,放入恒温摇床,25度震荡4小时,以封闭掉没有反应的活性基团;
5.偶联后磁珠的处理: 对偶联结束后的磁珠,必须要去除表面的非特异性结合和非共价键结合,分别用1ml缓冲液A和1ml缓冲液C,交替淋洗磁珠,磁液分离去除上清后,重复两次,以保证没有自由游离的配体。
6.磁珠的保存:用1ml缓冲液D淋洗磁珠,磁液分离后,去除上清,**后保存于缓冲液D中,于4度保存。
注意:
1.此操作方法可用于偶联单克隆抗体或其他蛋白质。如果配体是氨基酸或者带有氨基、巯基、或羟基的小分子化合物,可以溶解在缓冲液A中偶联;
2.禁止使用带有氨基、巯基或羟基的缓冲盐作为缓冲液使用,比如:Tris
3.建议所有的试剂都经过高压灭菌后使用。
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