人γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(Human γ-ECS)ELISA Kit厂家代测

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3.2.3 结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法. （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结.碱性磷酸一般用此法进行标记.交联方法一步法、两步法两种.在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体. ELISA中常用的酶一般都用此法交联.它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点.缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果.诹讲椒ㄖ校?br> 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体.也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结.两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低.人γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(Human γ-ECS)ELISA Kit厂家代测欢迎致电北京方程生物获取相关资料。

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人γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(Human γ-ECS)ELISA Kit厂家代测结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活.高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便.结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存.早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液.现在较**的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月.由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂.另外再加入**（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加DIEDANNA），以防止细菌生长.. 结合物的稀释液

样品收集、处理及保存方法 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激.使用不含热原和内毒素的试管.收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离, 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测.1000×g离心30分钟去除颗粒, 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物, 保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻,尽可能的不要使用溶血或高血脂血.如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤,不要在37℃或更高的温度加热解冻,应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻, 试剂的准备 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存,稀释前将标准品振荡混匀, 洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释.

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3.2.1酶 用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力.**在受检标本中不存在相同的酶.另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等. 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP).在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等.国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物.HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质.主酶无色糖蛋白在275nm波长处有**高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有**高吸收峰.HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?.0. HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点.值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力.高纯度的酶如保存不当，活力也会降低.酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验.. 国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶.常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取.不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000，酶作用的**适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，**适pH为9.6.在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低.

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