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人补体1q进口ELISA试剂盒报价
发布时间:2017-03-14 10:50:31  点击:0

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3.2.3 结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法. (1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结.碱性磷酸一般用此法进行标记.交联方法一步法、两步法两种.在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体. ELISA中常用的酶一般都用此法交联.它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点.缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果.诹讲椒ㄖ校?br> 先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体.也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结.两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低.人补体1q进口ELISA试剂盒报价欢迎致电北京方程生物获取相关资料。

 

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人补体1q进口ELISA试剂盒报价标本因素对ELISA测定的影响,血清是最常用的ELISA标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致,分为内源 性物质和外源性物质两种: 1. 内源性物质 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果.常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异 性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等. (1)类风湿因子 人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性. 解决该情况的办法是:①用F(ab)2替代完整的IgG;②标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);③检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本 稀释液中,使RF降解..

(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶.辣根过氧化物酶的标记常用此法.反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合.酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1-2/1.此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批实验结果不易重演.. 按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体.理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色.但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量.因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好.纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用.硫酸铵盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开.用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵. 结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度.使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性.所以必须对结合物的浓度予以选择.最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省.就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度.例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应.但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度

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可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液、分泌物和排泄物等均可作标本,以测定其中某种抗体或抗原成份,有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物),大部分ELISA检测均以血清为标本,血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清,制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得,除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本,在ELISA中血浆和血清可同等应用,血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色.

 

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