【实验材料】

1.实验器材

层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1);试管及试管架;量筒10m1;721型分光光度计

2.实验试剂

 (1) Tris-醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

 (2) 溴酚蓝溶液:称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。

 (3) 蓝色葡聚糖-2000溶液:称取蓝色葡聚糖-2000 10毫克，溶于2毫升Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。

 (4) 样品溶液:取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖-2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。

 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)

【实验操作】

1.实验凝胶的制备:商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G-25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris-醋酸溶液)洗涤2-3次，使pH和离子强度达到平衡，**后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。

 2.装柱:将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，**后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。

3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖-2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。**后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3-4cm。

 4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。

 5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。