2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，**后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得**多的是反相溶剂洗脱，以甲醇--水系统**为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇**为常见，先用50%氯仿--甲醇，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。

 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水)，样品用**少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解，过滤后，湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀)。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇)，样品用**少体积的氯仿--甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

 5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件:

梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

(2) 饱和层析柱:

用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。

(5) 洗脱:控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。

再生以备下次使用。

 1.装柱

装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄)，越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言，25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(**高至250cm)而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行**的清洗。

Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

 2.平衡

上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。

 3.洗脱液

为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。

 4.样品

样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。

 5.洗脱

洗脱流速应根据情况而定，**线性流速约12cm/min(反压1.5ba)，建议流速为1-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的