1.装柱

装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄)，越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言，25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(**高至250cm)而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行**的清洗。

Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

 2.平衡

上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。

 3.洗脱液

为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。

 4.样品

样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。

 5.洗脱

洗脱流速应根据情况而定，**线性流速约12cm/min(反压1.5ba)，建议流速为1-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的

【实验材料】

1.实验器材

层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1);试管及试管架;量筒10m1;721型分光光度计

2.实验试剂

 (1) Tris-醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

 (2) 溴酚蓝溶液:称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。

 (3) 蓝色葡聚糖-2000溶液:称取蓝色葡聚糖-2000 10毫克，溶于2毫升Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。

 (4) 样品溶液:取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖-2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。

 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)