(1) 预处理

称取Sephadex G-25(50-100目)约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2) 装柱

凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2-3h即可加样品分离。

(3) 加样

加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2-3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集

洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8-1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度**，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度**的管号。

(5) 凝胶的再生和回收

凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

【实验材料】

1.实验器材

层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1);试管及试管架;量筒10m1;721型分光光度计

2.实验试剂

 (1) Tris-醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

 (2) 溴酚蓝溶液:称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。

 (3) 蓝色葡聚糖-2000溶液:称取蓝色葡聚糖-2000 10毫克，溶于2毫升Tris-醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。

 (4) 样品溶液:取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖-2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。

 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)

【实验操作】

1.实验凝胶的制备:商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G-25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris-醋酸溶液)洗涤2-3次，使pH和离子强度达到平衡，**后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。

 2.装柱:将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，**后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。

3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖-2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。**后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3-4cm。

 4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。

 5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。