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信息标签:SP琼脂糖凝胶FF SP-Sepharose FF价格,供应,化工,化学试剂
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,**后出柱。如果使用反相溶剂洗脱, Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后,就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得**多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统**为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,**后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇**为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,**后用100%甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用**少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用**少体积的氯仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件:
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统,用了很多年,效果较好。
(2) 饱和层析柱:
用洗脱剂将凝胶摇匀,直立柱身,让其自然沉降,此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关,流出几个柱体种的洗脱剂,目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品,常压过滤。
(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
(5) 洗脱:控制流速,一般1drop/s以下,可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。
再生以备下次使用。
6 分离的技巧,**后说说我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。
(2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。
(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质
(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果**,方法很成型,有大量文献参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。
SP琼脂糖凝胶FF SP-Sepharose FF价格1.装柱
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄),越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言,25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言,不能说分布均一,也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(**高至250cm)而言也是同样的。在装柱前,层析柱和储槽都必须进行**的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中,要尽量避免过分搅拌,否则会破坏球形胶粒,且要避免使用磁力搅拌器。
在室温下,将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时,溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统,请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%,上层溶剂占25%,这时,悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内,在保证胶粒不变形的前提下,应在尽可能高的压力下装柱,反压不要超过1.5ba。
2.平衡
上样前,用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止,如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高调节器的位置,如使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。
3.洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
4.样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%,同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。
5.洗脱
洗脱流速应根据情况而定,**线性流速约12cm/min(反压1.5ba),建议流速为1-10cm/h。总体来说,较低的流速,具有较高的
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