2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，**后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得**多的是反相溶剂洗脱，以甲醇--水系统**为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇**为常见，先用50%氯仿--甲醇，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。

 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水)，样品用**少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解，过滤后，湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀)。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇)，样品用**少体积的氯仿--甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

 5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件:

梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

(2) 饱和层析柱:

用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。

(5) 洗脱:控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。

再生以备下次使用。

 6 分离的技巧，**后说说我的使用心得

(1) 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

(2)柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。

(3) 馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。

(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

(5)鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质

(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果**，方法很成型，有大量文献参考。

(7)填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。