使用方法

1. 乙醇浸泡：

在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

2.无盐水浸泡：

室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；

3. 盐酸浸泡：

在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性；

4. 将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；

5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值）；

6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1 即可；

7. 洗脱方法：

可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；

8. 在位清洗（CIP）

凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，**后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得**多的是反相溶剂洗脱，以甲醇--水系统**为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇**为常见，先用50%氯仿--甲醇，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。

 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水)，样品用**少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解，过滤后，湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀)。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇)，样品用**少体积的氯仿--甲醇溶解，过滤后，湿法上样。