【实验操作】

1.实验凝胶的制备:商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G-25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris-醋酸溶液)洗涤2-3次，使pH和离子强度达到平衡，**后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。

 2.装柱:将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，**后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。

3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖-2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。**后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3-4cm。

 4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。

 5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，**后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得**多的是反相溶剂洗脱，以甲醇--水系统**为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇**为常见，先用50%氯仿--甲醇，逐渐增加甲醇比例，**后用100%甲醇冲柱。

 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水)，样品用**少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解，过滤后，湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀)。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇)，样品用**少体积的氯仿--甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

 5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件:

梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

(2) 饱和层析柱:

用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。

(5) 洗脱:控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。

再生以备下次使用。

 6 分离的技巧，**后说说我的使用心得

(1) 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

(2)柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。

(3) 馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。

(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

(5)鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质

(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果**，方法很成型，有大量文献参考。

(7)填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。