5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件:

梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。

(2) 饱和层析柱:

用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。

(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。

(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。

(5) 洗脱:控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。

再生以备下次使用。

 6 分离的技巧，**后说说我的使用心得

(1) 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。

(2)柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。

(3) 馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。

(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

(5)鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质

(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果**，方法很成型，有大量文献参考。

(7)填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。

1.装柱

装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄)，越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言，25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(**高至250cm)而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行**的清洗。

Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

 2.平衡

上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。

 3.洗脱液

为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。

 4.样品

样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。

 5.洗脱

洗脱流速应根据情况而定，**线性流速约12cm/min(反压1.5ba)，建议流速为1-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的

(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果**，方法很成型，有大量文献参考。

(7)填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。