ELISA小常识：

间接法是检测抗体**常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原

(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

(3)加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。

(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

 Elisa试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。

 ELISA实验操作注意事项：

大部分实验室在使用酶标仪之前是通过目测判断结果，操作过程随意性较大，在使用酶标仪后操作必须规范：

A. 使用移液器加液，移液枪头不能混用。

B. 洗板要干净，避免交叉污染。

C. 严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。

D. 请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成注意做好清洁工作。

E. 不要在测量过程中关闭电源。

F. 对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到**效果。

G. 使用后盖好防尘罩。

H. 出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪。

 北京方程生物酶标试剂盒操作中出现的问题：现象、可能原因和解决办法：

1、 不同厂家生产的试剂盒因生产工艺和操作方法略有不同，务必按照所用试剂盒严格操作，否则容易产生检测结果的不确定性.

2、 若不同批号试剂的不同组分（A液或酶工作液），或不同试剂的不同组分进行交叉使用，有可能出现显色浅或本底高，花板等情形。

3、 加样时样品量误差，对于阴或很阳的标本影响不大，但对阈值附近的标本影响极大，建议校对加样器。

4、 反应时间的误差，做大量标本时，**孔和**后一孔以及一些特殊标本可能影响较大。

5、 由于滴瓶的精密性肯定不如加样器，不排除不同滴头滴量的误差。另外滴加过程中是否产生气泡、速度是否均匀，是否颤动等影响液量的因素均可导致以上情况。高标准要求时应使用加样器。

6、 阈值附近实际上是个灰区（gray scale）,不能截然分为阴性、阳性，国外厂家均要求对这部分可疑标本进行奇数次复检，以次数多者为准，如一次阳两次阴**后判为阴，但实际上是否为阴不好说，只有判为可疑，临床上可以让患者过一段时间后再测。

7、 肉眼观察稍显色，酶标仪打印为阴性的标本在实际工作中是难以避免的，肉眼目测结果不可靠，应以酶标仪判读为准。

8、 由阴性变为强阳性原因多为操作过程中漏加试剂等有关。

ELISA小常识：ELISA试验条件固相载体的选择：载体的种类比较多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。聚苯乙烯凹孔板是应用**广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。由于聚苯乙烯的工艺过程不是很稳定,造成各批次差异比较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法：⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，**后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应放弃不用。

ELISA小常识：

抗HIV-ELISA试剂目前对HIV的检测原料有了较大改进，主要如下：

（1）可用于检测血清或血浆中HIV IgM亚特异性抗体和检测HIV-1、2和多种亚型。

（2）标记的抗原：a.含HIV-1B亚型gp41和P24的HIV-1重组融合蛋白。b.可特异性检测血清或血浆中HIV M群的抗体，绝大多数HIV-1.0群和HIV-2群的抗体。c.gp36免疫调控区的HIV-2多肽可测定特异性的HIV-2抗体。d.gp41的俩段HIV 1.0群多肽，可测特异性HIV 1.0 群的抗体 和HIV 1M群的抗体。HIV-1.0.2对759份各类临床样品包括401份HIV-1感染不同阶段病人样品，204分HIV-2感染不同阶段病人样品，和154份与HIV无关的其他疾病患者的样品的检测结果。特异性：99.93%     灵敏度：100%

Elisa试剂盒说明：

1．检测原理：采用双抗体夹心ABC-ELISA法

2．试剂盒保存：2-8℃(频繁使用时)；-20℃(较长时间不用时)

3．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)

5．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

6. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。