检测方法：夹心法酶促酶联免疫吸附测试

包装规格：96份/盒

检测对象：人

适用样本：血清、血浆、全血

灵敏程度：最低检出量为 0.1 ng/ml

预期用途：本试剂盒用于定量检测未知样品中低氧诱导因子 1α的含量。

生产厂商：加拿大ELIXIR医药公司 电话 001-604-7381281 www.hcb-ca.com

【实验原理】

夹心法：辣根过氧化物酶直接标记特异性抗体和固相包被的抗体分别与样本中抗原的不同位

点相结合。抗原的浓度和免疫复合物呈正相关的函数关系，并表现在剂量反应曲线上，以该

曲线为依据，通过计算分析后，可以对样本进行定量，从而得到未知样本中的质量浓度。

【试剂组成】

1. 精密度微孔板：预先包被的固相微孔板。

密封铝箔袋， Costar聚丙乙烯PPE微孔，内含干燥剂。12条X8孔，1块微孔板框架。 每条微孔可以根据具体使用数量进行单独拆卸。2-8摄氏度冷藏储存，真空密闭的微孔 板可以保存12个月以上。剩余的微孔板放回含有干燥剂的铝箔袋内可以保存5个月以上。

2. 酶结合物：辣根过氧化物酶直接标记。10毫升/1瓶，含稳定剂透明液体2-8度冷藏储存。

3. 标准品：1000微升/6瓶，含稳定剂的透明液体。2-8摄氏度冷藏储存。

I- 0 ng/ml，II- 1.0 ng/ml， III- 2.5 ng/ml， IV- 5.0 ng/ml， V- 10 ng/ml，VI- 25 ng/ml

4. 显色剂A：  3%双氧水，无色透明液体。6毫升/1瓶，2-8摄氏度冷藏储存。

5. 显色剂B： TMB四甲基联苯胺，无色透明液体。6毫升/1瓶，2-8摄氏度避光储存。 注：显色剂A和显色剂B的使用：

方式一、先依次在微孔内加入50微升显色剂A后再依次加入50微升显色剂B，避光反应15分钟。 方式二、提前将显色剂A与显色剂B按照1：1的比例混合后备用，混合后的溶液室温避光可以 储存15分钟，加样时直接加入100微升混合溶液即可。如果混合溶液在未使用时呈现淡蓝色， 请勿使用。

6. 终止液：10%硫酸，无色透明液体。6毫升/1瓶，2-8摄氏度冷藏储存。终止液具有轻微 的腐蚀性，如接触皮肤用冷水冲洗即可。

7. 浓缩洗涤液：磷酸盐缓冲液，无色透明液体。8毫升/2瓶，2-8摄氏度冷藏储存。 按照1：9的比例配制洗涤液。即8毫升浓缩洗涤液加入70毫升蒸馏水。稀释后的洗液可

2-8摄氏度长期冷藏储存。如果出现结晶物，可放置于37摄氏度水浴箱内5-10分钟。 浓缩洗涤液出现浑浊或絮状物不影响使用。

【实验仪器】

1. 酶标仪：读取微孔板内各孔液体的吸光度。 定量试验不使用阈值设置。报告种类选择原始数据报告，吸光度报告，浓度报告，曲线 报告（需设立内置打印机或电脑联机）。

标准品设置包括标准品的数量，浓度，单位。 标准曲线设置包括曲线种类的设置和坐标轴的设置。 虑光片应设置检测波长为450纳米，参考波长为630纳米的双波长测量，使用双波长测量 则不必设空白孔。

ELISA定量测定时，应选用logit-log或四参数数据处理模式。负相关数据，拟合数学模 型的优选顺序是四参数LOGISTIC回归，LOGIT-LOG线性回归，三次多项式（3/2次方程）。

2. 洗板机：自动清洗微孔板内未结合的残余物质。 将提前配置的洗液加入自动洗板机的洗液瓶里，然后快速甩掉微孔板内反应液于废液池 内，用洗板机洗板3次，每次浸泡1分钟，清洗后拍干反应板。洗板机喷水口很容易被洗 液形成的结晶物堵塞，造成各孔间较大差异，因此应当注意按时对洗板机进行清洁保养。

3. 水浴箱：对微孔反应板进行恒定的加温加湿。 将水浴箱调节至37摄氏度，正负误差2摄氏度，当水浴箱内置温度指示针达到37摄氏度 时，将微孔板放入，使水浴箱内的液面与微孔反应板面平行，以达到均衡的温度和湿度。

4. 微量振荡器：对微孔内的混合溶液进行充分混匀。将已用封口贴封闭的微孔板平稳牢固 的放置于微量振荡器的载物平台上，以中等档位的力度震荡30秒。

【实验耗材】

1. 洗液瓶：手工清洗微孔板内未结合的残余物质。将提前配置的洗液加入洗液瓶里，然后 快速甩掉微孔板内反应液于废液池内，在废液池上方将微孔板倾斜45度以洗液瓶出水口 对准微孔逐一冲洗5次，将各孔注满洗液，静置1分钟，甩掉微孔板内洗液，按照以上步 骤重复3次。手工清洗应注意冲洗水流的力度适中，不宜过大。

2. 移液器：移取液体试剂和标本。 吸取液体时，移液器保持竖直状态，将吸头插入液面下2至3毫米，用大拇指将按钮按至 第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继 续按按钮至第二停点吹出残余的液体后松开按钮。 如果样品是组织匀浆、体液分泌物、细胞培养液可以先吸放几次样品以润湿吸头，按下 按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点，将按钮按至第一停点排出样品后取下有残留液 体的吸头。 使用多道（如8道或12道）移液器，则可以将移液器第一道对准第一个枪头，然后倾斜 地插入，前后方向摇动即可卡紧，吸头卡紧后可看到连接部分形成清晰的密封圈。

3. 移液器吸头：配合移液器使用。在使用前将吸头置于120摄氏度15-20分钟灭菌，后经烤 箱100摄氏度烘干水分即可使用。吸取酶结合物可以使用同一个吸头加样，吸取显色剂A

可以使用同一个吸头加样，吸取显色剂B可以使用同一个吸头加样，吸取终止液C可以使 用同一个吸头加样。每个标准品与待测样品不能重复使用同一个吸头加样。

4. 蒸馏水和500毫升量杯：配置洗涤液。每瓶浓缩洗液为10毫升，全部倒入量杯中，按照1： 10的比例加入90毫升的蒸馏水。稀释后的洗液可在2-8摄氏度长期冷藏储存。

5. 自制冰浴装置：稳定实验加样时的温度在加样时，首孔与末孔加样时间间隔过长（应尽 可能控制在15分钟内），会导致各微孔间有不同的起始反应时间，从而影响到测量值的 准确性和重复性。

将冰浴装置放置于4摄氏度的冰箱或冰柜内15-30分钟后取出，将微孔板平稳摆放在冰浴 装置上，进行实验加样，这样可以缩小孔间差，提高实验精度。当实验室温度高于28

摄氏度时，建议采取此种方法。

6. 自制避光装置：使加入显色剂A和B的微孔板能在避光的条件下反应。 方式一、可以将加入显色剂的微孔板放置在无杂物的抽屉内。 方式二、可以将本试剂盒的盒盖扣在加入显色剂的微孔板上，使外部可见光无法照射到即可。

【样品处理】

1. 大部分标本在2-8摄氏度，可放置保存3天，负20摄氏度，可放置保存1个月以上，负70

摄氏度，可放置保存6个月以上。长时间储存的标本，在使用时需要离心。制备好的新 鲜标本可以在22-25摄氏度于8小时内使用，如超过时间应视情况冷藏或冷冻保存。 反复冻溶会使抗体效价跌落，标本如需保存做多次检测，宜少量分装冻存。不要使用水 浴解冻样品或试剂。

2. 血清：采集新鲜血液，加入无菌试管中。采血后室温静置1小时，用离心机4摄氏度，2500

转离心15分钟，取上清部分，分装冻存备用。

3. 血浆：采集新鲜血液，加入无菌试管中。按1:9加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸 橼酸钠），30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染，也可以直接用抗凝管采集血 液，建议使用EDTA抗凝。用离心机4摄氏度，2500转离心10分钟，取上清部分，分装冻 存备用。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。抗凝不完全 的标本因纤维蛋白原干扰会造成假阳性。

【注意事项】

1. 本试剂盒是仅供研究使用的体外检测试剂。混用其他批次其他厂商，无法保证检测效果。

2. 标本宜在新鲜时检测。从冰箱取出试剂后，室温平衡(20-25°C)达到 30 分钟。

3. 浓缩洗涤液需用新鲜蒸馏水或去离子水按要求稀释，不合格的蒸馏水可能使空白值增高。

4. 2-8°C 妥善保存已打开而未使用的酶标板。必须密封干燥。

5. 加样前应使溶液充分混匀，按规定的量和顺序进行。并将液体加在孔底，避免加在孔壁 上部，注意不可出现气泡.避免污染。

6. 加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间

7. 所有样品都应视同为潜在危险能够致病的污染。实验期间，必须戴一次性手套，因为已 知的测试方法不可能提供各种样品不会传送传染物质的完全保证。

8. 按照病毒灭活的方式处理的所有使用完毕的样品。

9. 所有废液添加次氯酸钠到 1.0%浓度至少 30 分钟。 才能再做无害化处理。

10. 加显色剂尽量避免溅出孔外。不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的 B 显色剂不能使用。

11. 显色剂避免接触金属器械，避免在空气中暴露时间过长。远离热或火源。

12. 终止显色完后应及时终止，加终止液时避免出现气泡